High Performance Liquid Chromatograph
의역하자면 정밀도 높은 액체 크로마토그래피.
1 설명
일반 크로마토그라피와 마찬가지로 이동상과 고정상에 대한 affinity의 차이를 가지는 구성물질들로 이루어진 혼합물을, 구성물질간의 이동 속도 차이를 이용해 분리해내는 기기. 일반 크로마토그라피와 다른 점이 있다면, 일반 크로마토그라피는 삼투압이나 중력을 이용하여 이동상(mobile phase)과 구성물질을 이동시킨다면, HPLC는 pump를 이용해 가하는 압력으로 구성물질을 이동시킨다는 것이다.
또한 그냥 육안으로 관찰하는 일반 크로마토그라피와는 달리 UV detector등의 다양한 detector를 이용하여 용질을 확인하는 것도 차이점.
2 사용법
Column안에 정제된 혼합물이 삽입되면, 혼합물 안의 구성물들은 고정상(stationary phase)과의 상호작용 때문에 column 안을 다른 속도로 이동하게 된다. 특정 구성물질이 이 column을 완전히 통과하는데 걸리는 시간을 retention time이라고 층한다. 일정한 상태(온도, 염도 등등)에서 동일한 물질의 retention time은 항상 동일하다고 본다.
column 내의 고정상들은 대게 bead로 이루어져 있으며, 이 bead의 입자가 작을수록 크로마토그래피의 정밀도를 높인다. 또한 정밀도가 높을 수록 더 적합한 pressure, backpressure을 사용할 가능성이 높아진다.
대부분의 이동상은 수용성 용매로 물이 주로 쓰이고, 그에 대칭되는 유기용매로써 메탄올이나 아세토나이트릴이 많이 쓰인다. 수용성 용매에는 혼합물이 서로 분리되는 것을 돕기 위해 염이나 산[1]을 약간씩 넣어주는 경우가 많다. 이동상의 구성은 일정하거나(isocratic elution mode) 변화하는데(gradient elution mode), 일정한 이동상은 만들기 쉽다는 장점만이 존재하고(...) 변화하는 이동상은 구성물질을 더 정밀하게 분리해낼 수 있지만 이런 기능을 가진 기기는 비싸고, 인력으로 해결하려면 귀찮다(...).
보통의 gradient elution mode는 아세토나이트릴 5%에서 시작해 95%까지 늘리는 방법을 사용한다.
3 UV
용액 안의 용질은 빛을 쏘았을 때의 흡광도로 감지하는데, HPLC를 통해 뭘 분석하느냐에 따라 어떤 파장의 빛을 사용할까가 결정된다. 214nm은 peptide bond를 감지하는데 쓰이고, 280nm은 페닐알라닌이나 트립토판을 감지하는데 쓰인다.
4 종류
Partition chromatography
가장 기초적인 chromatography. paper chromatography나 thin layer chromatograhy 등과 원리는 크게 다르지 않다.
Reversed phase chromatography
무극성의 고정상과, 물(즉 극성)의 이동상을 사용한다. 가장 흔한 고정상은 silica. 거기에 알킬기가 붙은 염화규소로 표면이 변성된다. 이런 고정상에서는 구성물질의 retention time은 극성이 낮을수록 늘어난다.
이 크로마토그라피의 장점은 retention time을 늘려 정밀도를 늘리고 싶을 때, 이동상에 물만 부어주면 된다는 것이다.
Size exclusion chromatography
혹은 gel chromatography. gel[2] 사이의 공간으로 혼합물 내의 구성물질들이 통과하며, 구성물질의 분자 크기에 따라 구성물질들의 서로 다른 retention time을 가진다. 보통 낮은 정밀도를 가지고 있어서, 추가적인 크로마토그래피를 할 때 가끔 사용되는 정도. 그리고 단백질을 변성시키지 않고 분리하거나 3차, 4차 구조를 알려 할 때 유용한 방법이다.
Ion exchange chromatography
요약하면 IC. retention time은 이동상의 이온과 고정상의 charged site(대전된 부위) 사이의 attraction에 따라 결정된다. 이동상의 charge가 고정상과 같으면 retention time이 짧아지고, 다르면 길어진다.