NMR

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1 개요

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 줄여서 NMR spectroscopy, 간단하게 NMR이라고도 쓴다. 한국말로는 핵자기공명분석법. 유기화합물의 분석에서 탄소와 수소 사이의 framework를 분석해 유기물의 구조, map을 파악하는데 쓰이는 방법이다. IR spectroscopy나 UV spectroscopy와 함께 사용하면 매우 복잡한 유기물의 구조도 알아낼 수 있다. 분석 대상의 전자가 모두 짝이 지어진 경우 diamagnetic NMR, 그렇지 않은 경우 paramagnetic NMR로 분류할 수 있으며, 학부 레벨에서 배우는 대부분의 NMR 테크닉은 diamagnetic NMR 중심으로 되어 있다. 이는 대부분의 분석물들이 diamagnetic이기 때문인데, 금속이 포함된 촉매나 라디칼 등에서 paramagnetic인 것들을 볼 수 있다. Paramagnetic NMR은 보통 시프트 범위와 피크가 넓어서 커플링이 묻히고 해상도가 낮으며 이와 비슷한 테크닉으로는 electron paramagnetic resonance(EPR, ESR)이 있다.

샘플의 종류에 따라서 분류할 수도 있다. 대다수의 샘플은 수소를 모두 이중수소로 바꾼 용매에 화합물을 녹인 용액 형태이지만 파트를 갈아끼우면 고체상태로도 분석을 진행할 수 있고 이를 solid NMR이라 부른다.

보통 기기를 300MHz NMR, 500MHz NMR 등으로 지칭하는데, 앞의 숫자는 수소의 공명주파수이다. 이것이 높을수록 자기장이 강력하다는것을 의미하며 spectrum의 퀄리티도 좋아지지만 가격도 비싸거니와, 자석의 덩치도 크고 무거워진다. 그래서 지하, 혹은 지하가 없다면 1층에다가 설치하는 것이 보편적이고 심지어 한 층에 안들어가서 그 윗층까지 차지하는 경우도 있다. 웬만한 유기 화합물들의 분석은 200~600MHz 정도로도 충분하고 그 이상은 단백질 분석 등에 쓰인다.

대형 NMR과는 반대로 휴대가 가능한(!) 소형 NMR도 있다. 위에 서술한 설치식 NMR의 경우 초전도자석을 가동하기 위해 액체헬륨이 떨어지지 않게 주기적으로 공급해줘야 하는 반면, 60MHz대의 NMR은 그런 거 필요 없다. 주변에 NMR 시설이 없을 때 빠르고 간단하게 결과를 얻을 수 있는 것이 장점이다. 자기장이 약하기 떄문에 sensitivity는 낮지만 샘플의 농도를 올린다든지 스캔 수를 늘린다든지 해서 그럭저럭 봐줄만한 ¹H 데이터를 뽑아낼 수 있다. 하지만 ¹H와 달리 ¹³C는 natural abundance가 적어서 헬. 한동안 크고 아름다운 대형, 초대형 NMR이 계속 개발되면서 잊혀지는가 싶더니 이제 더 크게 만들기도 힘들다 간편함과 저렴한 비용을 무기로 다시 주목받고 있다.

대표적인 NMR 관련 제조 회사로는 Bruker와 Varian이 있었으나 Varian은 2010년 애질런트 테크놀로지에 인수된 후 2014년 증발했다. 하지만 쉽게 바꿀 수 없는 기기이다보니 2016년 기준으로도 아직 많이 쓰이고 있다. 2021년까지 고객 지원이 계속될 예정이고, 이후 3년동안 비슷한 수준의 지원을 할거라지만 부품 재고 여부는 장담할 수 없다.

이 기술을 의학쪽으로 발전시킨것이 MRI이다.

2 원리

원리는 탄소나 수소의 것을 포함한 원자핵이 양의 전하를 띄고 있고 스핀을 가지면 일종의 자석같은 역할을 가지게 되는데, 이 때 외부자기장을 걸어주어 이들을 정렬시키면 이 자석들이 외부자기장에 평행하거나 반대로 배치되게 된다.

배치된 원자핵에 적당한 전자기 복사를 가해주면 에너지를 흡수하여 스핀플립이 일어나게 되며 이 때 원자학이 전자기 복사와 공명한다고 표현한다. 이 공명주파수는 원자핵이 가지는 성질과 가해지는 외부자기장의 세기에 의해 결정되며 당연히 외부자기장이 강할수록 스핀플립을 일으킬 때 더 많은 에너지가 필요하다. 이 외부자기장은 주로 4.7에서 7.0 테슬라 정도로 가해준다.

이때 탄소나 수소의 원자핵이 흡수하는 공명주파수는 해당 탄소나 수소가 결합되어있는 원자나, 결합된 원자에 결합된 원자에까지 영향을 받는다. 원자핵 주위의 전자가 스핀을 가져 생기는 자기장이 외부 자기장을 가리는 등의 이유 때문이다. 이때문에 분석시 피크가 나타나면 분석한 유기물에 어떤 원자와 결합한 수소가 있는지, 어떤 원자와 결합한 탄소가 있는지 알 수 있다! 이를 응용하면 분석된 유기물이 후보중에 무엇인지, 아니면 아예 맨 처음에 언급한 다른 분석법과 병행해 분자구조 자체를 알아낼 수도 있다.

2.1 Multi-dimensional NMR

기본적으로 한번에 한 원소만을 관찰하는 것을 1D NMR이라고 하며, 여러 개를 묶어서 같이 보는 것은 multi-dimensional NMR이라고 부른다. 2D의 경우 ¹H와 ¹H 혹은 ¹H와 ¹³C를 주로 보고, 3D는 여기에 ¹⁵N을 추가한다. 자주 쓰이는 2D NMR은 다음과 같다. 수소와 탄소를 예로 들었지만 다른 원소를 쓸 수도 있다.

• COSY: 수소-수소. 같은 탄소에 결합되어 있는 다른 수소 혹은 바로 옆 탄소에 결합되어 있는 수소를 나타낸다.
• HMQC/HSQC: 수소-탄소(1-bond correlation). 어떤 수소가 어떤 탄소에 결합되어 있는지 표시.
• HMBC: 수소-탄소(multibond correlation). 어떤 수소가 직접 결합되어 있는 탄소와 결합한 다른 탄소, 그 탄소와 결합된 또다른 탄소(...)를 보여준다. 운이 좋으면 그 옆의 탄소도.
• NOESY/ROESY: 수소-수소(correlation across space). 결합과는 상관 없이 거리상 가까운 수소들을 표시한다.

x-axis에만 chemical shift가 표시되는 1D와는 달리, y-axis에도 chemical shift가 표시된다. 보통 x-axis(f2)에 수소, y-axis(f1)에 탄소가 들어간다. 피크는 동그란 점으로 표시되는데 이게 크고 진할수록 더 intense하다는 얘기다. 쉽게 생각해서, 피크가 듬성듬성 산봉우리처럼 솟아 있고 우리는 그걸 위에서 아래로 내려다보는 것이라고 보면 된다. 1D 스펙트럼에서 intensity를 높이면 피크가 위아래로 늘어나지만 2D 스펙트럼에서는 바닥을 향해 한 층씩 내려가는 개념이다 보니 동그라미가 점점 더 커지는 것이다.

3D NMR은 주로 단백질 분석에 쓰인다.

2.2 주요 원소

동위 원소	스핀	Gyromagnetic ratio (106 rad T-1s-1)
1H	1/2	267.522
2H	1	41.066
6Li	1	39.372
11B	3/2	85.847
13C	1/2	67.283
15N	1/2	-27.126
19F	1/2	251.815
29Si	1/2	-53.190
31P	1/2	108.394
195Pt	1/2	58.385

3 이용 방법

3.1 샘플 제작

기본적으로는 적당량의 화합물에 NMR 용매를 넣어 용액으로 만들면 된다. 샘플 만들기에 자신이 있다면 튜브에 직접 넣어서 만들 수도 있지만 그렇지 않거나 잘 녹을지 확신이 서지 않는다면 별도의 바이알에 용액을 만들고 튜브로 옮기는 방법도 좋다. NMR 튜브도 가격이 천차만별인데 싸구려 튜브는 표면이 거칠거나 튜브가 완벽하게 반듯하지 않은 경우도 있어서 스펙트럼의 질이 좋지 않거니와 probe안에서 깨지고 고장을 유발할 수 있기 때문에 어느 정도 품질이 보장된 튜브를 써야 한다. 흔히 쓰는 5mm튜브를 사용할 경우 샘플 용액의 양은 600µl(0.6ml)정도가 적당하다. 더 적게 쓰면 스펙트럼의 퀄리티 저하를 불러오고 더 많이 쓰면 용매 낭비에다 농도 하락으로 같은 퀄리티의 스펙트럼을 뽑으려면 더 오래 돌려야 하므로 시간을 낭비하게 된다.

주로 쓰는 NMR 용매는 CDCl₃, DMSO-d₆, D₂O, (CD₃)₂CO, toluene-d₈ 등이 있다. 이들은 ¹H NMR에서 시그널이 나타나지 않게 H를 모조리 중수소 D로 바꾼 용매들인데, D로 교체되지 않은 미량의 H로 인해 solvent peak라 불리는 피크가 나타난다. 이들의 시프트도 잘 기록이 되어 있기 때문에 시프트 기준점과 해상도 확인시 쓸모가 있다.

¹H를 볼 것이 아니라면 사실 아무 용매나 써도 상관은 없지만 중수소가 없으면 automatic shimming을 이용하지 못하고 수동으로 쉬밍을 해줘야 해서 매우 귀찮다. NMR용매를 10%정도만 넣어도 자동쉬밍 기능을 이용할 수 있으니 웬만하면 넣는 것을 추천한다.

3.1.1 민감한 샘플일 경우

만일 분석 대상이 산소나 수분에 취약하다면 위의 방법으로 샘플 제작이 불가능하다. 이 경우 튜브에 샘플을 넣고 플라스틱 뚜껑 대신 토치로 튜브를 녹여 입구를 막아버리는 기법을 쓰면 된다. 다음은 sealing하는 방법인데 비경험자가 하기에는 매우 위험한 작업이니 글로 읽는 것보다 남들이 직접 하는것을 반드시 보고 여러번 연습해야 한다.

1. 충분한 길이의 NMR 튜브에 고무 마개를 씌우고 Schlenk line에 주사바늘을 이용, 연결시켜 진공상태로 만든다. 이 튜브를 토치로 살짝 데워 내부의 수분을 제거한다. 한 곳에 너무 오래 대고 있으면 구멍이 날 수 있으니 주의바람.
2. 몇분 뒤 튜브가 식으면 아르곤으로 튜브를 채운 뒤 계속 아르곤이 들어가는 상태에서 드라이아이스+아세톤 배스에 튜브를 중간정도 넣는다. 이는 나중에 부분진공상태로 바꿨을때 용매가 날아가는 현상을 방지하기 위함이다.
3. 이 튜브에 미리 만들어놓은 샘플을 주사기로 집어넣은 후 진공밸브를 약간 열었다가 닫아서 부분진공상태로 만든다.
4. 튜브가 빠지지 않을 정도로 적당히 내리고 배스도 샘플이 다 잠길 정도이면서 dewar의 바닥과 튜브의 바닥 사이에 어느정도의 공간이 생길 정도로 높이를 낮춰준다.
5. 토치로 유리벽을 녹이면서 분리한다. 토치 불꽃을 작고 뾰족하게 만든 뒤 막고 싶은 부분에 돌아가면서 구멍이 나지 않을 정도로 홈을 세개 판 뒤 토치를 댄 상태에서 튜브를 잘 돌려가면서 동시에 밑으로 슬슬 내리면 완성. 이 때 막을 부분이 고무마개에 너무 가까지 있으면 마개에 불이 붙으니 마개 끝에서 1cm정도 떨어진 부분에 홈을 내야 한다.

입구를 막아버리는 것이기 때문에 튜브를 재활용하려면 입구를 다시 뚫어줘야한다. 유리커터나 끌로 흠집을 낸 뒤 부러뜨리면 되는데 흠집을 충분히 내지 않거나 너무 힘을 주면 뾰족하게 깨져서 위험할 수 있으니 두꺼운 장갑을 착용하거나 천 등으로 감싸는 것이 필수이다. 내부 상태에 따라 퐁, 퍽 등의 소리가 날 수 있으니 놀라지 말자.

3.1.2 실시간 모니터링

튜브내에서 리액션을 진행하여 반응물이나 생성물을 실시간으로 관찰할 수 있어서 rate study에 유용하다. NMR로 보기도 전에 미리 반응물을 다 튜브에 넣으면 가장 중요다고 할 수 있는 시작부분을 놓쳐버릴 수 있으므로 일단 튜브를 probe에 집어넣고 반응물을 주사기로 주입하여 이미 NMR이 돌아가고 있는 상태에서 리액션을 시작하면 된다. 아래 방법은 민감한 화합물에도 적용 가능하다. ¹⁹F이 해상도도 좋고 스펙트럼 뽑는 시간이 빨라서 이런 실험에 좋다.

1. NMR튜브에 고무 마개를 씌우는데, 입구 안쪽에 하나를 넣고 꼭지를 자른 뒤 바깥쪽에 한번 더 씌우는 형태의 이중마개를 추천한다. 이것을 schlenk line에 연결, 진공상태로 만든 후 토치로 데워 내부의 수분을 제거한다.
2. 몇분 뒤 튜브가 식으면 밸브를 돌려 아르곤으로 바꾼 후 반응물을 전달할 기구를 튜브에 끼운다. 이 기구는 가늘고 긴 플라스틱 튜브 한쪽에 반응물을 넣을 주사기 바늘 지름과 같은 별도의 플라스틱 튜브를 끼워 에폭시로 부착하고 다른 한쪽에는 지름이 약간 넓은 주사바늘을 끼운 것이다. 이 주사바늘로 고무마개에 구멍을 내어 플라스틱 튜브를 NMR튜브 중간정도 지점으로 밀어넣은 뒤 주사바늘을 마개에서 빼서 다른 튜브가 부착되어있는 곳까지 이동시킨다. 이 기구는 probe에 튜브를 완전히 집어넣었을 때 반대쪽 입구가 밖에서 보이도록 길이가 충분히 길어야 한다. 작업을 잘 수행했고 새는 곳이 없다면 기구 반대쪽으로 아르곤이 나오는데, 이 상태로 5분간 둔다.
3. 반응물 한 가지의 용액을 준비해서 주사기에 넣어 둔다. 이 때 준비할 양은 보통 0.1ml+튜브 기구 내부 부피인데, 이렇게 하면 최종적으로 NMR튜브에는 0.1ml만 들어가게 된다. 이 주사기를 튜브 기구에 끼워놓고 나머지 재료들을 다른 주사기를 통해 NMR튜브에 집어넣는다.
4. 배스를 사용하여 NMR튜브와 내용물을 적정 온도로 내린 후 기구를 거의 바닥, NMR튜브가 구부러지기 시작하는 지점까지 밀어넣는다. 그 뒤 라인에서 NMR튜브를 떼고 고무마개에 찐득한 그리스를 발라 미세한 구멍을 막는다.
5. 배스와 NMR튜브가 담긴 dewar를 포함하여 연결된 부분을 다 들고 가서 보통처럼 probe에 집어넣고 온도조절을 위해 잠깐 기다렸다가 array셋업으로 NMR을 시작한 뒤 얼른 가서 주사기 내용물을 주입하면 된다.

당연하게도 반응을 저어줄 수 없기 때문에 밀도가 높다든지 해서 잘 섞이지 않는 반응에는 부적합하다. 그냥 ReactIR 쓰자

3.2 데이터 뽑기

300px
이미지 출처
스피너와 튜브가 끼워진 뎁스게이지.

샘플을 spinner에 끼운 후 depth gauge에 넣어 올바른 지점으로 조절한다. 뎁스게이지를 보면 아랫부분에 구멍이 뚫려있고 길이가 표시되어 있는데, 샘플의 양이 충분하다면 세팅되어있는 정도로 바닥까지 최대한 살짝 밀어넣고 만일 양이 부족하면 중간으로 표시된 부분에 샘플의 중간지점을 맞추면 된다. 주의할점은 이 뎁스게이지 설정보다 샘플을 더 깊게 집어넣으면 절대로 안된다. 마찬가지로, 스피너가 헐렁거린다면 즉시 다른 스피너로 바꿔끼워주자. 깊이를 확인한 후 반드시 뎁스게이지를 빼고 probe에 스피너와 튜브만 넣어야 한다. 별거 아닌 당연한 일 같지만 의외로 이걸 까먹어서 프로브 고장내고 욕먹는사람이 있다고 한다.

¹H나 ¹³C 실험은 워낙 사람들이 많이 써서 웬만하면 이미 셋업이 잘 되어 있다. 400MHz 이하의 경우 샘플을 probe에 집어넣고 회전, 용매 설정, z0찾기, 자동 쉬밍, 시작버튼 누르면 끝이고 500MHz이상에서는 투입 후 튜닝 단계가 추가된다. 샘플 회전을 할 수 없는 경우 x1, y1, xz, yz정도를 수동으로 조절해줘야 한다.

2D실험은 일단 ¹H와 HSQC/HMQC/HMBC의 경우 ¹³C 데이터를 먼저 뽑은 다음, 그 세팅을 이용하여 2D데이터를 얻는다.

¹H와 ¹³C 이외의 다른 원소를 관찰하려면 capstick이나 프로브, 필터 등을 적절히 교체해야 하는 경우가 많은데 많이 해보지 않았다면 관리자에게 도움을 요청하자. 괜히 나섰다가 프로브가 망가지기라도 하면 관리자는 물론이고 온 학과 사람들에게 욕이란 욕은 다 먹게 된다.

상온이라면 신경쓰지 않아도 되지만 특정 온도에서 실험하기를 원할 경우 프로브마다 사용 가능한 온도 범위가 정해져 있어서 이를 사전에 반드시 확인해야한다. 상온에서 약 60도까지는 공기를 써도 되지만 상온보다 낮은 온도를 원하거나 60도 이상일 경우 질소로 바꿔줘야한다. 온도를 낮출 때 액체질소나 드라이아이스 배스를 사용하는데 이때 보통 공기처럼 사용하는 가스에 수분이 있다면 얼음이 생겨서 가스통로가 막히기 때문. 가스가 통하지 않으면 샘플을 프로브에서 뺄 수 없는건 둘째치고 온도조절에 지장이 생겨서 프로브 내부 히터가 타버리는 참사가 발생할 수 있기에 꼭 질소를 사용하여야 한다.

3.3 주의사항

• 양질의 NMR 튜브 사용
• 스피너와 튜브 위치 체크
• NMR 주위에서 모든 철제 도구 사용 금지 - 보이지 않는 힘이 어떤 것인지 느낄 수 있을 것이다. 자기공명영상 문서에도 나와있듯, 자기장이 절대 만만하지 않다. 특히 자석에 붙는 재질로 만들어진 가스통을 주변에 가져가면 가스통이 NMR에 딱 붙어버리는 참사가 벌어진다.
• 같은 맥락에서 이런 자기장은 시계, 전자기기, 신용카드 고장을 유발하므로 NMR 주위로 들고 가지 말아야 한다.
• 아래 동영상처럼 갑자기 웬 가스가 빠르게 뿜어져 나올 경우 얼른 대피하고 관리자에게 알려야 한다. 이것을 quenching이라고 하는데, 어떠한 이유로 내부 코일에 문제가 생겨서 열이 발생한 결과 액체헬륨이 기화되는 현상이다. 헬륨의 팽창하는 속도와 정도가 어마어마하기 때문에 밀폐된 공간에서 특히 질식사와 동상의 위험이 크다. 복구비용도 매우 크다.

4 결과 분석

기본적으로는 다른 연구원들이 갈아넣어져서 열심히 작성한 표가 있으니 그래프에서 나타나는 피크가 어느 원자결합을 의미하는지 표에서 찾아서 결과를 얻으면 된다.

일반적으로 그래프에서 x축은 chemical shift이며, TMS를 기준으로 삼는다.(TMS는 테트라메틸규소로 규소에 메틸기가 4개 달려있는 심플한 구조이다) 이 TMS의 chemical shift를 0으로 잡으면 대부분의 피크는 TMS보다 아래쪽에 나타난다.

그래프는 피크가 나타나는 형태로 쓸 때도 있지만, 이를 적분한 그래프를 쓰기도 한다.

4.1 수소원자에서

수소원자의 NMR에서는 결과가 단순 피크로 나타나는게 아니라, 여러 개의 피크가 붙어있는 형태로 나오기도 한다. 이를 multiplet이라고 한다. 이 현상은 이웃한 원자와의 상호작용과 커플링 때문에 발생한다.

이때, 화학적으로 완전히 동등한 원자들은 이 분할을 만들지 못하고, n개의 동등한 이웃한 원자핵들이 n+1개의 피크를 만든다. 무슨소리냐면 현재 피크어 해당하는 H, 이 H에 연결된 C가 있고, 다시 이 C에 연결된 C에 서로 동등한 H가 n개 달려있으면 n+1개의 피크가 생성된다. 이 쪼개짐 또한 분석에 있어 중요한 정보이다.

4.2 탄소원자에서

모든 탄소원자에서 NMR이 가능한 것은 아니다. 일반적인 원자량 12짜리, 중성자 6개짜리 탄소는 NMR 분석이 불가능하며, 원자량 13짜리 탄소만 NMR이 가능하다. 이 방법을 이용해 동등하지 않은 탄소의 수를 셀 수 있다.

5 기타

골때리는 축약어가 유난히 많다. COSY, NOESY, DANTE, INADEQUATE, PANSY 정도는 애교, HEHAHA혹은 HOHAHA같은 엉뚱한 약어도 많으며 Proton-enhanced Nuclear Induction Spectroscopy 같은 것도 있다. 이쯤 되면 과학자들이 일부러 이러는 것이 확실하다.